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2014-11-11DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白

藥品試劑
1、DEAE纖維素DE-23 1.5g
2、0.5mol/L NaOH 100ml
3、0.5mol/L HCl 50ml
4、0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液250ml
5、0.02mol/L pH7.3(含0.2mol/L NaCl)的Tris-HCI緩沖液50ml
實驗步驟
1、離子交換劑的處理:稱取1.5gDFAE纖維素(DE-23)幹粉,加入0.5mol/L NaOH溶液(約50ml),輕輕攪拌,浸泡至少0.5小時(不超過1小時),用玻璃沙漏鬥過濾,并用去離子水洗至近中性,抽幹後,放入小燒杯中,加50ml的0.5mol/L HCl,攪勻,浸泡0.5小時,用去離子水洗至近中性,再用0.5mol/L NaOH重複處理一次,用去離子水洗至近中性後,抽幹備用(因DEAE纖維素昂貴,用後務必回收)。實際操作時,通常纖維素是以浸泡過并回收的,按“堿-酸”的順序洗即可,因為酸洗後較容易用水洗至中性。堿洗時因過濾困難,可以先浮選除去細顆粒,抽幹後用0.5mol/L NaOH 0.5mol/L NaCl溶液處理,然後水洗至中性。
2、裝柱與平衡:先将層析柱垂直裝好,在燒杯内用0.02mol/L pH7.3 Tris-HCI緩沖液洗纖維素幾次,用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱,然後用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。
3、上樣與洗脫:上樣前先準備好梯度洗脫液。采用20ml 的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCI緩沖液和20ml含0.2mol/L濃度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCI緩沖液,進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的50ml燒杯,一個裝20ml含NaCl的高離子強度溶液,兩一個裝入20ml低離子強度溶液,放在磁力攪拌器上,在低離子強度溶液的燒杯内讓入一個小攪拌子(在細塑料管内放入一小段鐵絲,兩端用酒精燈加熱封口),将此燒杯置于攪拌器旋轉磁鐵的上方。将玻璃三通插入兩個燒杯中,上端接一段乳膠管,夾上止水夾,用吸耳球小心地将溶液吸入三通,立即夾緊乳膠管,使兩個燒杯溶液形成連通,注意兩個燒杯要放妥善,切勿使一杯高,一杯低。
樣品小心地加到層析柱上,不要擾動柱床,注意要從上樣開始時使用部分收集器收集,控制流速每10分鐘2.5-3ml。上樣後用緩沖液洗兩次,然後再用約20ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質,至A280降到0.1以下,夾住層析柱出口,将恒流泵入口的細塑料導管放入不含NaCl的低離子強度溶液的小燒杯中,用膠布固定塑料管,加好層析柱,打開磁力攪拌器,放開層析柱出口,開始梯度洗脫,連續收集洗脫液,兩個小燒杯中的洗脫液用盡後,為洗脫充分,也可将所配置的剩餘30ml高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續洗脫,控制流速每10分鐘2.5-3ml。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
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